28 TCN198 : 2004: Histamin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc

Ngày Thứ Hai, 23 tháng 1, 2012 Blog của Báo Mới Hà Nội chia sẻ với bạn đọc bài viết 28 TCN198 : 2004: Histamin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc
Chúc bạn xem tin tức vui vẻ !!

Histamin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Histamin in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography

1 Ðối tượng và phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng histamin trong sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5 mg/kg.
2 Phương pháp tham chiếu
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo Tiêu chuẩn NMKL số 99 - 1981(Nordic committee on food analysis No 99 -1981).
3 Nguyên tắc
Histamin có trong mẫu thủy sản được tách chiết bằng metanol. Dịch chiết được làm sạch trên cột trao đổi anion; sau đó, được tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-Phthal alđehyt (OPT). Hàm lượng dẫn xuất histamin được định lượng trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.
4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử
4.1 Thiết bị, dụng cụ
4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.
4.1.2 Cột sắc ký lỏng C18, kích thước cột L x ID: 50 x 4,6 mm, kích thước hạt: 5 mm.
4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 6 000 - 30 000 vòng/phút (HEIDOLPH DIAX 900).
4.1.4 Bể điều nhiệt hoạt động ở nhiệt độ 20 -100oC (GRANT Y14).
4.1.5 Máy lắc tốc độ 50 - 500 vòng/phút (IKA ề KS 260 basic).
4.1.6 Máy đo pH, dải pH từ 2 đến 12 (Knick 766).
4.1.7 Cân phân tích, độ chính xác 0,0001 g.
4.1.8 Cột thủy tinh (khóa teflon, kích thước: 300 x 10,5 mm ID x 13 mm OD). 4.1.9 Bình tam giác, bình định mức và pipet thủy tinh các loại.
4.1.10 Giấy lọc 0.45 mm (Whatman No.1).
4.2 Hoá chất Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm:
4.2.1 Nước cất dùng cho HPLC.
4.2.2 Metanol dùng cho HPLC.
4.2.3 Axetonitril dùng cho HPLC.
4.2.4 Axit clohyđric (HCl) đậm đặc 37 %.
4.2.5 Natri hyđroxit (NaOH) rắn.
4.2.6 Kali đihyđro phosphat (KH2PO4) rắn.
4.2.7 o-Phthal alđehyt (OPT) 99%, được bảo quản lạnh.
4.2.8 Trietylamin (TEA).
4.2.9 Histamin đihyđroclorua (C5H11Cl2N3), M = 184,07 g/mol.
4.2.10 Axit phosphoric (H3PO4) đậm đặc 85 %.
4.2.11 Nhựa trao đổi anion, Dowex loại 1 x 8, kích thước hạt 50 -100 mesh.
4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử
4.3.1 Các dung dịch chuẩn histamin

4.3.1.1 Dung dịch chuẩn histamin gốc 1000 mg/l: hoà tan 0,1656 g histamin đihyđroclorua (4.2.9) trong axit HCl 0,1 M rồi định mức đến 100 ml. Dung dịch này bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh.
4.3.1.2 Dung dịch chuẩn histamin 10 mg/l: pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn gốc histamin 1000 mg/ l (4.3.1.1) với dung dịch axít HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi định mức đến 100 ml. Dung dịch này bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh.
4.3.1.3 Các dung dịch chuẩn histamin làm việc: pha loãng lần lượt 1; 2 và 3 ml dung dịch chuẩn histamin 10 mg/l (4.3.1.2) trong dung dịch axit HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi định mức đến 100 ml để được các dung dịch chuẩn 0,1; 0,2 và 0,3 mg/l. Chuẩn bị mới các dung dịch chuẩn mỗi khi phân tích.
4.3.2 Các dung dịch thử
4.3.2.1 Dung dịch axit HCl 2,5 M: pha loãng 125 ml axit HCl (4.2.4) trong nước cất (4.2.1) để có 500 ml.
4.3.2.2 Dung dịch axit HCl 1 M: pha loãng 40 ml dung dịch axit HCl 2,5 M (4.3.2.1) trong nước cất để có 100 ml.
4.3.2.3 Dung dịch axit HCl 0,1 M: pha loãng 10 ml dung dịch axit HCl 1 M (4.3.2.2) trong nước cất để có 100 ml
4.3.2.4 Dung dịch NaOH 1 M: hòa tan 40 g NaOH (4.2.5) trong 1000 ml nước cất.
4.3.2.5 Dung dịch OPT: hòa tan 0,100 mg OPT (4.2.7) trong 100 ml metanol (4.2.2). Dung dịch bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh trong chai sẫm màu.
4.3.2.6 Dung dịch H3PO4 1,19 M: pha loãng 121,8 ml H3PO4 đậm đặc 85% (4.2.10) với nước cất (4.2.1) để có 1000 ml.
4.3.3 Chuẩn bị nhựa trao đổi anion: nhựa trao đổi anion được đổ vào trong dung dịch NaOH 1 M (4.3.2.4) với tỉ lệ tương ứng 15 ml NaOH/1 g nhựa. Tiến hành khuấy đều dung dịch, để yên ít nhất trong 30 phút rồi gạn bỏ phần dung dịch. Lặp lại thao tác trên. Cuối cùng rửa nhựa với nước cất. Sau đó, đổ nhựa lên giấy lọc rồi rửa nhiều lần với nước cất (4.2.1) cho đến khi hết NaOH. Nhựa bảo quản được 1 tuần trong nước cất.
4.3.4 Chuẩn bị pha động: hòa tan 1.089 g KH2PO4 (4.2.6) trong gần 600 ml nước ((4.2.1). Thêm 100 ml axetonitril (4.2.3) và 0,10 ml TEA (4.2.8), chỉnh pH đến 7,30 + 0,05 trên máy đo pH (4.1.6). Sau đó, chuyển dung dịch vào bình định mức 1000 ml (4.1.9) rồi định mức tới vạch bằng nước cất (4.2.1). Chú thích: trong quá trình chuẩn bị pha động, dung dịch phải được lọc qua giấy lọc 0,45mm (4.1.10) và đuổi khí bằng bể siêu âm trước khi sử dụng.

5 Phương pháp tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Nghiền ít nhất 200 g mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Cân chính xác 10 g mẫu đã được nghiền đồng thể (kí hiệu W) cho vào bình tam giác 150 ml (4.1.9).
5.1.2 Thêm 50 ml metanol (4.2.2), lắc đều trong 2 phút. Ðặt bình chứa dung dịch mẫu trên bể điều nhiệt (4.1.4) ở nhiệt độ 60oC trong 15 phút . Sau đó, chuyển toàn bộ sang bình định mức 100 ml; tráng bình tam giác bằng metanol (4.2.2).
5.1.3 Ðể nguội dung dịch tới nhiệt độ trong phòng rồi định mức đến vạch bằng metanol (4.2.2) để có 100 ml (kí hiệu V1). Lắc đều dung dịch rồi lọc qua giấy lọc (4.1.10). Dịch chiết này bền được vài tuần lễ nếu được bảo quản lạnh.
5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thuỷ sản đã được xác định không chứa histamin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định t aị Ðiều 5.1.
5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ppm
Thêm chính xác 1 ml dung dịch chuẩn histamin 1000 mg/l (4.3.1.1) vào 10 g mẫu trắng đã được nghiền đồng thể. Tiến hành chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồinhư chuẩn bị với mẫu thử theo qui định t aị Ðiều 5.1.

5.4 Làm sạch mẫu

5.4.1 Chuẩn bị cột làm sạch Nhồi nhựa trao đổi anion đã được chuẩn bị (4.3.3) vào cột thủy tinh (4.1.8) đến chiều cao khoảng 8 cm và giữ không để khô cột. Trước khi sử dụng phải rửa cột thủy tinh với 10 ml nước cất (4.2.1).
5.4.2 Làm sạch mẫu Lần lượt cho 1 ml dịch chiết thu được tại các Ðiều 5.1, 5.2 và 5.3 (kí hiệu V2) qua cột, rồi rửa cột bằng 4 - 5 ml nước cất (4.2.1). Thu dịch chảy ra vào bình 50 ml đã chứa 5 ml dung dịch axit HCl 1 M (4.3.2.2). Khi lớp dung dịch cách mặt trên lớp nhựa khoảng 2 mm phải cho tiếp nước cất (4.2.1) vào cột cho đến khi thu được khoảng 35 ml dịch giải hấp. Khóa cột rồi định mức phần dịch giải hấp thu được bằng nước cất (4.2.1) để có 50 ml (kí hiệu V3).

5.5 Tạo dẫn xuất huỳnh quang

5.5.1 Dung dịch xác định đường chuẩn
Hút chính xác 5 ml các dung dịch chuẩn histamin làm việc (4.3.1.3) vào các bình định mức 50 ml, thêm 3 ml dung dịch NaOH 1 M (4.3.2.4) vào mỗi bình rồi lắc đều. Sau khoảng 5 phút, thêm 1 ml dung dịch OPT (4.3.2.5) vào mỗi bình. Sau đúng 4 phút, tiếp tục thêm 3 ml dung dịch H3PO41,19 M (4.3.2.6) vào mỗi bình, định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi lắc đều các bình.
Chú thích: phải lắc đều dung dịch sau mỗi lần thêm hóa chất ít nhất 1 lần trong quá trình tạo phản ứng với dung dịch OPT (4.3.2.5).

5.5.2 Mẫu trắng

Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu trắng đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1.

5.5.3 Mẫu xác định độ thu hồi

Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1.

5.5.4 Mẫu thử

Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu thử đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1.
5.6 Tiến hành phân tích trên HPLC
5.6.1 Ðiều kiện phân tích:
a. Cột sắc ký : cột Licrocart C18, kích thước 50 x 4,6 mm, 5 mm (4.1.2).
b. Nhiệt độ cột : 40oC.
c. Pha động : hỗn hợp gồm: KH2PO4 , axetonitril và TEA (4.3.4).
d. Tốc độ dòng : 1 ml/phút.
đ. Bước sóng kích thích : l = 350 nm.
e. Bước sóng phát xạ : l = 444 nm.
g. Thể tích tiêm : 20 ml.
5.6.2 ổn định cột sắc ký trong 30 phút tại chế độ làm việc.
5.6.3 Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5.1). Dựng mối quan hệ tuyến tính của diện tích píc sắc ký theo nồng độ.
5.6.4 Tiêm dịch chiết mẫu trắng (5.5.2); dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi (5.5.3) và dịch chiết mẫu thử (5.5.4) đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC. Mỗi dịch thực hiện 2 lần. Tính diện tích trung bình và xác định nồng độ histamin trong dịch chiết từ đường chuẩn. Tính hàm lượng histamin trong mẫu theo Ðiều 6. 5.7 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích
5.7.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm
Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%.
5.7.2 Ðộ thu hồi (R)
Ðộ thu hồi của mẫu được xác định theo mỗi lần phân tích mẫu. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 90 đến 110%.
5.7.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.
6 Tính kết quả Hàm lượng histamin có trong mẫu thử được tính theo công thức sau:

C x V1 x V3
M (mg/kg) = -----------------
W x V2

Trong đó:
- M là hàm lượng histamin có trong mẫu, tính theo mg/kg.
- C là nồng độ histamin có trong dịch chiết mẫu (5.6.4), tính theo mg/ml.
- V1 là thể tích dịch mẫu thử (100 ml) đã được định mức (5.1).
- V2 là thể tích dịch chiết (1 ml) chuẩn bị được làm sạch (5.4.2).
- V3 là thể tích dịch đã được làm sạch (5.4.2) chứa trong bình định mức (50 ml).
- W là khối lượng (10 g) của mẫu thử đã được nghiền đồng thể (5.1).
Chú thích: Nếu kết quả tính trên mẫu lớn hơn 15 mg/100 g thủy sản thì phải pha loãng dịch
chiết mẫu và thực hiện lại qui trình từ Ðiều 5.4.

 

28 TCN194 : 2004: Các chất chuyển hoá thuộc nhóm Nitrofuran trong thuỷ sản và sản phẩm thủy sản

Ngày Blog của Báo Mới Hà Nội chia sẻ với bạn đọc bài viết 28 TCN194 : 2004: Các chất chuyển hoá thuộc nhóm Nitrofuran trong thuỷ sản và sản phẩm thủy sản
Chúc bạn xem tin tức vui vẻ !!

Các chất chuyển hoá thuộc nhóm nitrofuran trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ-khối phổ
Residues of metabolites of nitrofurans group in fishery products - Method for quantitative analysis by LC/MS/MS

1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng của các chất chuyển hoá thuộc nhóm nitrofuran gồm furazolidon, furaltadon, nitrofurantoin và nitrofurazon trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1 mg/kg.
2 Phương pháp tham chiếu
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp của Viện Kiểm soát Chất lượng sản phẩm nông nghiệp Hà lan (RIKILT).
3 Giải thích thuật ngữ và các từ viết tắt

3.1 Giải thích thuật ngữ Trong Tiêu chuẩn này, các thuật ngữ dưới đây được hiểu như sau:
3.1.1 Dư lượng liên kết với mô là các chất tồn dư do có các liên kết đồng hoá trị với các đại phân tử trong cơ thể động vật.
3.1.2 Ion sơ cấp (precursor ion) là ion được tạo ra và chọn lọc sau giai đoạn MS thứ nhất, thông thường, nhưng không nhất thiết nó là một ion phân tử mang điện dương.
3.1.3 Ion thứ cấp (product ion) là ion được tạo ra và chọn lọc trong giai đoạn MS thứ hai, ion này được sinh ra từ ion sơ cấp trong quá trình phân ly do va chạm.
3.2 Các từ viết tắt
3.2.1 LC/MS/MS: Sắc kí lỏng/khối phổ/khối phổ.
3.2.2 CID (Collision induced dissociation): phân ly do va chạm.
3.2.3 ESI (Electron spray ionization): ion hoá bằng phun điện tử.
3.2.4 HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

4 Nguyên tắc

Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hoá nhóm nitrofuran trong sản phẩm thuỷ sản được thuỷ phân bằng axit clohyđric loãng để thu được mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này được dẫn xuất hoá bằng 2-nitrobenzalđehyt. Ðịnh tính và định lượng các chất dẫn xuất bằng LC/MS/MS bằng cách sử dụng các đồng vị đơtơri như chất chuẩn nội.

5 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch
5.1 Thiết bị, dụng cụ

5.1.1 Cân phân tích, độ chính xác 0,01 mg.
5.1.2 Cân phân tích, độ chính xác 0,01 g.
5.1.3 Máy nghiền
5.1.4 Máy ly tâm
5.1.5 Tủ ấm (có thể điều chỉnh được ở khoảng nhiệt độ 37oC 2oC)
5.1.6 Hệ thống cô bằng khí Nitơ
5.1.7 Máy lắc Vortex.
5.1.8 Màng lọc PTFE, 13mm, 0,45mm.
5.1.9 Giấy thử pH
5.1.10 Pipet 100ml
5.1.11 Hệ thống LC/MS/MS:

- Hệ thống sắc kí lỏng: Water Alliance 2690 hoặc tương đương gồm bơm và hệ thống tiêm mẫu; - Cột bảo vệ pha đảo C18 (Symmetry Sentry Guard hoặc tương đương), kích thước 20 x 3,9mm; - Cột C18 (Symmetry hoặc tương đương) kích thước150 x 3,0 mm, 5mm, - Ðầu dò khối phổ dạng bốn cực với giao diện ESI (Triple quadrupole Micromass Quattro Ultima hoặc tương đương).

5.1.12 ống ly tâm 14ml, polypropylen hoặc thuỷ tinh, có nắp đậy
5.1.13 Máy lắc ống nghiệm
5.1.14 Lọ đựng mẫu cho HPLC
5.1.15 Bình định mức 10ml, 20ml, 100ml
5.1.16 Dụng cụ thủy tinh thông thường.
5.1.17 Máy lắc đảo đầu (Heidolf REAX2) hoặc tương đương
5.2 Hóa chất
Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích gồm:
5.2.1 Metanol
5.2.2 Axit clohydric (HCl) 32%.
5.2.3 2-nitrobenzalđehyt (C7H5NO3) viết tắt làNBA.
5.2.4 Natri phosphat ngậm nước Na3PO4.12H2O.
5.2.5 Natri hyđroxyt khan (NaOH).
5.2.6 Etyl axetat (CH3COOC2H5).
5.2.7 Axit axetic (CH3 COOH).
5.2.8 Axetonitril (CH3CN).
5.2.9 Metanol -d, 99,5% D. 5.2.10 Nước
5. 3 Chất chuẩn
5.3.1 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ).
5.3.2 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon (AMOZ).
5.3.3 1-amino-hyđantoin hyđroclorit (AHD).
5.3.4 Semicarbazit (SEM) hyđroclorit.
5.3.5 3-amino-2- oxazolidinon-d4 hyđroclorit (AOZ-d4).
5.3.6 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon-d5 (AMOZ-d5).
5.3.7 1-amino-hyđantoin hyđroclorit-d2 (AHD-d2).
5.3.8 3-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-2-oxazolidinon (NPAOZ).
5.3.9 5-metylmorfolino-3-((2-nitrophenyl)metylen)-3-amino-2-oxazolidinon (NPAMOZ).
5.3.10 1-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-hyđantoin (NPAHD).
5.3.11 (2-nitrophenyl) metylen-semicarbazit (NPSEM).
5.4 Chuẩn bị các dung dịch
5.4.1 Axit clohyđric 0,2M: hoà tan 20 ml HCl (5.2.2) trong 1000ml nước (5.2.10). 5.4.2 Natri hyđroxit 2M: hoà tan 80g NaOH khan (5.2.5) vào 1000ml nước (5.2.10).
5.4.3 2-nitrobenzalđehyt (NBA) 100mM trong metanol nồng độ 0,1M: hoà tan 1,51g NBA (5.2.3) vào 100ml metanol (5.2.1).
5.4.4 Natri phosphat 0,3M: hoà tan 11,4 g Na3PO4.12H2O (5.2.4) vào 100ml nước (5.2.10).
5.4.5 Dung môi hoà tan mẫu: trộn 50ml axetonitril (5.2.8), 450 ml nước (5.2.10) và 0,5 ml axit axetic (5.2.7).
5.4.6 Pha động A: trộn 1ml axit axetic (5.2.7) với 1000ml nước (5.2.10), lọc qua màng lọc 0,45mm (5.1.8).
5.4.7 Pha động B: trộn 900ml axetonitril (5.2.8) với 100ml nước (5.2.10) và 1ml axit axetic (5.2.7), lọc qua màng lọc 0,45mm (5.1.8).
5.5 Các dung dịch chuẩn
5.5.1 Các dung dịch chuẩn gốc
5.5.1.1 Dung dịch chuẩn gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM, AOZ-d4, AMOZ-d5, NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM (50mg/l trong metanol) Cân chính xác từ khoảng 1 đến 5 mg 0,02mg các chất chuẩn nói trên. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc bằng cách hoà tan trong metanol (5.2.1), lưu ý đến độ tinh khiết của chất chuẩn.
5.5.1.2 Dung dịch chuẩn gốc AHD-d2 (50mg/l trong metanol-d) Cân chính xác từ khoảng 1 đến 5 mg 0.02mg các chất chuẩn nói trên. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc bằng cách hoà tan trong metanol-d (5.2.9), lưu ý đến độ tinh khiết của chất chuẩn.
5.5.2 Hỗn hợp các dung dịch chuẩn
5.5.2.1 Hỗn hợp MM1 (1mg/l trong metanol) gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM Lấy 200 ml từ mỗi dung dịch gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM (5.5.1.1) cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch với metanol (5.2.1).
5.5.2.2 Hỗn hợp IS1 (1 mg/l trong metanol-d) gồm AOZ-d4, AMOZ-d5,AHD-d2Lấy 200 ml từ mỗi dung dịch gốc AOZ-d4, AMOZ-d5 (5.5.1.1) và AHD-d2(5.5.1.2) cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch với metanol-d (5.2.9).
5.5.2.3 Hỗn hợp NP1 (1mg/l trong metanol) gồm NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM Lấy 460 ml dung dịch gốc NPAOZ (5.5.1.1), 332 ml dung dịch gốc NPAMOZ (5.5.1.1), 432 ml dung dịch gốc NPAHD (5.5.1.1) và 554 ml dung dịch gốc NPSEM (5.5.1.1) cho vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức đến vạch với metanol (5.2.1).
5.5.3 Pha loãng các hỗn hợp dung dịch chuẩn
5.5.3.1 Hỗn hợp chuẩn MM2 (50 mg/l trong metanol) gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM Lấy 1,00 ml hỗn hợp chuẩn MM1 (5.5.2.1) cho vào bình định mức 20ml, định mức đến vạch với metanol (5.2.1).
5.5.3.2 Hỗn hợp chuẩn nội IS2 (50 mg/l trong metanol-d) gồm AOZ-d4, AMOZ-d5,AHD-d2 Lấy 1,00 ml hỗn hợp chuẩn IS1 (5.5.2.2) cho vào bình định mức 20ml, định mức đến vạch với metanol-d (5.2.9).
5.5.3.3 Hỗn hợp chuẩn NP2 (100 mg/l trong metanol) gồm NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM Lấy 2,00 ml hỗn hợp chuẩn NP1 (5.5.2.3) cho vào bình định mức 20ml, định mức đến vạch với metanol (5.2.1).
5.5.4 Dung dịch chuẩn làm việc của các dẫn xuất nitrophenyl - WS1 (1mg/l) Lấy 1,00 ml hỗn hợp chuẩn NP2 (5.5.3.3) cho vào bình định mức 1000ml, định mức đến vạch với dung môi hoà tan mẫu (5.4.5). Tất cả các dung dịch chuẩn phải được bảo quản trong bóng tối ở nhiệt độ 4oC. Các dung dịch chuẩn gốc có thể sử dụng trong 1 năm. Các hỗn hợp chuẩn có thể sử dụng trong 1 tháng. Dung dịch chuẩn làm việc (5.5.4) có thể sử dụng trong 1 tuần.
6 Phương pháp tiến hành
6.1 Chuẩn bị mẫu
6.1.1 Mẫu thử nghiệm Cân chính xác 1,0 0,05 g mẫu cần kiểm nghiệm đã được đồng nhất bằng máy nghiền (5.1.3) cho vào ống ly tâm 14ml (5.1.12). Bổ sung 40ml hỗn hợp chuẩn nội IS2 (5.5.3.2), đồng nhất và để yên trong 15 phút.
6.1.2 Mẫu kiểm soát chất lượng
6.1.2.1 Mẫu kiểm soát âm tính: mẫu trắng không chứa AOZ, AMOZ, AHD và SEM Cân chính xác 1,0 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng nhận), bỏ vào ống ly tâm 14ml (5.1.12). Bổ sung 40 ml hỗn hợp chuẩn nội IS2 (5.5.3.2) và để yên trong 15 phút. Sau đó, tiến hành thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo qui định tại Ðiều 6.2.1.
6.1.2.2 Mẫu kiểm soát dương tính: mẫu trắng được bổ sung AOZ, AMOZ, AHD và SEM Cân chính xác 4 phần có khối lượng 1,0 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng nhận), bỏ vào 4 ống ly tâm 14ml (5.1.12). Bổ sung các dung dịch chuẩn theo cách ghi trong Bảng 1 rồi để yên trong 15 phút. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo qui định tại Ðiều 6.2.1.

Bảng 1 - Chuẩn bị mẫu kiểm soát dương tính
Nồng độ trong mẫu (mg/kg)Hỗn hợp chuẩn MM2 (5.5.3.1) (ml)Hỗn hợp chuẩn nội IS2 (5.5.3.2) (ml)0,510401204024040510040

6.1.2.3 Mẫu kiểm soát độ thu hồi: mẫu trắng bổ sung các chất dẫn xuất nitrophenyl của AOZ, AMOZ, AHD và SEM chuẩn. Cân chính xác 2 phần có khối lượng 1,0 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng nhận), bỏ vào 2 ống ly tâm 14ml (5.1.12). Bổ sung 40ml dung dịch chuẩn nội IS2 (5.5.3.2) rồi để yên trong 15 phút. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo qui định tại Ðiều 6.2.1. Sau khi làm bay hơi etyl axetat (6.2.3), thêm vào một mẫu 20ml hỗn hợp chuẩn NP2 (5.5.3.3) và 480ml dung môi hoà tan mẫu (5.4.5). Thêm vào một mẫu khác 50ml hỗn hợp chuẩn NP2 (5.5.3.3) và 450ml dung môi hoà tan mẫu (5.4.5). Sau đó, tiến hành chuẩn bị mẫu phân tích (6.2.4) với công đoạn lọc.
6.2 Xử lý mẫu Chú thích: Vì các chất dẫn xuất nitrophenyl rất nhậy với ánh sáng nên toàn bộ qui trình xử lý mẫu phải được tiến hành dưới ánh sáng yếu (ánh sáng vàng).
6.2.1 Thuỷ phân và dẫn xuất hoá Thêm 5 ml axit clohyđric 0,2M (5.4.1) và 50ml dung dịch 2-NBA trong metanol (5.4.3)vào các ống nghiệm chứa mẫu (6.1.1; 6.1.2.1; 6.1.2.2; 6.1.2.3). Ðậy nắp ống và lắc bằng tay để phân tán mẫu. Ðặt lên máy lắc ống nghiệm (5.1.13) rồi đặt cả hệ thống vào trong tủ ấm. ủ mẫu qua đêm ở nhiệt độ 37 2oC.
6.2.2 Trung hoà Sau khi làm nguội, thêm 500 ml dung dịch Na3PO4 0,3M (5.4.4) vào mẫu. Lắc mẫu bằng tay. Ðiều chỉnh pH về 70,5 bằng dung dịch NaOH 2M (5.4.2), kiểm tra pH bằng giấy thử pH (5.1.9). Lắc bằng tay và để yên trong 5 phút. Kiểm tra lại pH và điều chỉnh thêm nếu cần thiết.
6.2.3 Chiết Thêm 4ml etyl axetat (5.2.6) vào mẫu đã điều chỉnh pH. Chiết mẫu bằng cách đặt trên máy lắc đảo đầu (5.1.17) trong 20 phút. Ly tâm mẫu trong 10 phút ở tốc độ 2000 vòng/phút. Chuyển lớp hữu cơ ở phía trên sang một ống ly tâm 14ml (5.1.12) sạch. Lặp lại bước chiết bằng cách thêm 4ml etyl axetat (5.2.6) vào phần mẫu còn lại, đóng nắp ống ly tâm rồi đặt trên máy lắc đảo đầu (5.1.17) trong 20 phút. Ly tâm mẫu trong 10 phút ở tốc độ 3500 vòng/phút. Lấy lớp hữu cơ và kết hợp với phần hữu cơ đã lấy ở lần đầu rồi làm bay hơi cho đến khô ở nhiệt độ 45oC với hệ thống cô bằng khí nitơ (5.1.6) với tốc độ dòng khí chậm. Chú thích: tổng thể tích phần hữu cơ phải lớn hơn 6 ml, nếu không phải chiết thêm một lần nữa.
6.2.4 Chuẩn bị mẫu phân tích Hoà tan cặn khô bằng 500ml dung môi hoà tan mẫu (5.4.5), lắc trên máy lắc Vortex (5.1.7) trong 20 giây. Lọc dịch đục qua màng lọc 13mm, 0,45mm (5.1.8) và thu dịch lọc vào lọ vial cho HPLC (5.1.14).
6.2.5 Phân tích trên LC/MS/MS
6.2.5.1 Ðiều kiện máy LC a. Tốc độ: 0,4 ml/phút; b. Thể tích mẫu tiêm: 50 ml; c. Nhiệt độ cột: 40oC; d. Toàn bộ thời gian phân tích: 22 phút; đ. Pha động: chế độ gradien theo Bảng 2

Bảng 2 - Ðiều kiện gradien dung môi của máy LC

Thời gian (phút)Pha động A (5.4.6) (%)Pha động B (5.4.7) (%)0901019010145545161090181090199010

6.2.5.2 Ðiều kiện của đầu dò MS a. Tỉ số chia: xấp xỉ 1 : 2 b. Kiểu ion hoá: ESI, dương c. Ðiện thế mao quản: 2,7 kv d. Ðiện thế khối nón: 30 v đ. Nhiệt độ nguồn: 120oC e. Nhiệt độ khử dung môi: 300oC g. Tốc độ dòng khí khử dung môi: 500 l/h h. Tốc độ khí qua khối nón: 200 l/h i. Khí gây phân ly bằng va chạm: Argon, p = 3,2.10-3 bar.
6.2.5.3 Ðiều kiện phân ly MS/MS NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD và NPSEM bị phân ly thành các ion thứ cấp liên quan đến cấu trúc. Các chất đồng vị đánh dấu được sử dụng làm chất chuẩn nội cũng có cách phân ly tương tự (Bảng 3).

Bảng 3 - Các điều kiện phân ly MS/MS

Thành phầnIon sơ cấp (m/z)Ion thứ cấp (m/z)Thời gian lưu (s)Năng lượng va chạm (eV)Cửa sổ (phút)NPAMOZ335 0,5262 0,5 291 0,50,3 0,315 150,0 - 8,5 0,0 - 8,5NPAMOZ-d5340 0,5296 0,50,3150,0 - 8,5NPAHD249 0,5134 0,5 178 0,50,2 0,215 158,5 - 13,0 8,5 - 13,0NPAHD-d2251 0,5134 0,50,2158,5 - 13,0NPSEM209 0,5166 0,5 192 0,50,2 0,210 108,5 - 13,0 8,5 - 13,0NPAOZ236 0,5104 0,5 134 0,50,3 0,317 1713,0 -18,0 13,0 -18,0NPAOZ-d4240 0,5134 0,50,31713,0 -18,0

Chú thích: các ion thứ cấp có cường độ cao nhất được gạch chân.

6.2.6 Kiểm tra hiệu năng của hệ thống LC/MS/MS Tiêm dung dịch chuẩn làm việc 1mg/l (5.5.4). Xác định tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) đối với bước chuyển có cường độ thấp nhất. Tỷ lệ S/N phải lớn hơn 6. Lặp lại bước tiêm để kiểm tra sự lặp lại của thời gian lưu, diện tích pic và tỉ lệ các ion.
6.2.7 Trình tự tiêm mẫu Các mẫu sẽ được phân tích theo trình tự sau: a. Dung môi trắng; b. Mẫu kiểm soát âm tính (6.1.2.1); c. Mẫu kiểm soát dương tính (6.1.2.2); d. Mẫu kiểm soát độ thu hồi (6.1.2.3); đ. Dung môi trắng; e. Mẫu cần kiểm nghiệm (6.2.4); g. Dung môi trắng; h. Mẫu kiểm soát âm tính (6.1.2.1); i. Mẫu kiểm soát dương tính (6.1.2.2).

7 Tính kết quả

7.1 Tính tỉ số ion theo công thức sau:

100 x A1
R (%) = -----------(1)
A2

Trong đó: - R là tỉ số ion (%).

- A1 là diện tích của pic ion thứ cấp có cường độ thấp nhất.- A2 là diện tích của pic ion thứ cấp có cường độ cao nhất.

Rs - Rm
DR (%) = ------------- x 100 (2)
Rm

7.2 Tính độ lệch tương đối của tỉ số ion theo công thức sau:

Trong đó:- DR là độ lệch tương đối giữa tỉ số ion của chất cần phân tích trong mẫu kiểm với tỉ số ion trung bình của chất đó trong mẫu kiểm soát dương tính có nồng độ 1 mg/kg và cao hơn (%).- Rs là tỉ số ion của chất cần phân tích trong mẫu kiểm (1).- Rm là tỉ số ion trung bình của chất cần phân tích trong mẫu kiểm soát dương tính có nồng độ 1 mg/kg và cao hơn (%) (1).

Rt
Rrt = ----------(3)
RtIS

7.3 Tính thời gian lưu tương đối theo theo công thức sau:

Trong đó: - Rrt là thời gian lưu tương đối.
- Rt là thời gian lưu của chất cần phân tích.
- RtIS là thời gian lưu của chất chuẩn nội (đối với NPSEM thì NPAHD-d2 là chất chuẩn nội).
7.4 Tính độ lệch chuẩn của thời gian lưu tương đối theo công thức sau:

Rrts - Rrtm
DRrt (%) = ------------x 100 (4)
Rrtm

Trong đó: - DRrt là độ lệch tương đối giữa Rrt của chất cần phân tích trong mẫu kiểm so với Rrt của chất đó trong mẫu kiểm soát dương tính (%).
- Rrts là thời gian lưu tương đối của chất cần phân tích trong mẫu kiểm.
- Rrtm là thời gian lưu tương đối trung bình của chất cần phân tích trong mẫu kiểm soát dương tính.
7.5 Chất cần phân tích được khẳng định là có mặt khi các yêu cầu sau được thoả mãn:
a. Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cho mỗi ion phải không nhỏ hơn 3:1.
b. Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối, sử dụng nhiều loại kỹ thuật khối phổ theo qui định trong Bảng 4.

Bảng 4 - Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối
Cường độ tương đối
(% của pic cơ sở)
LC-MS, LC-MSn
(tương đối)
Lớn hơn 50 %
20 %
Từ lớn hơn 20 đến 50 %
25 %
Từ lớn hơn 10 đến 20 %
30 %
Không lớn hơn 10 %
50 %

Sp
RF = --------- (5)
SpIS

7.6 Tính hệ số tín hiệu cho từng chất cần phân tích theo công thức sau:

Trong đó: - RF là hệ số tín hiệu.
- Sp là tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích.
- SpIS làdiện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội (đối với NPSEM, NPAHD-d2 được sử dụng làm chất chuẩn nội).

7.7 Tính lượng chất cần phân tích có mặt trong mẫu kiểm theo công thức sau:

RF - b
X = ----------
a

Trong đó: - X là lượng chất cần phân tích có trong mẫu kiểm (mg/kg). (*)
- RF là hệ số tín hiệu (công thức 5).
- b là độ dựng của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến tính.
- a là độ dốc của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến tính. (**)
Chú thích: (*) : tính theo khối lượng chất chuyển hoá chưa bị dẫn xuất hoá.
(**): dựng đồ thị tín hiệu của mẫu kiểm soát dương tính với nồng độ chất chuẩn bổ sung và áp dụng hồi qui tuyến tính.

Phụ lục A
(tham khảo)
Sự chuyển hoá của các chất thuộc nhóm nitrofuran

Dược chất Chất chuyển hóa